W Super Mario Bros. 3 Mario i Luigi wraz z księżniczką Toadstool muszą wyprawić się w nową przygodę, by ocalić Królestwo Grzybów przed złowrogim Bowserem. Tym razem jednak nie będą musieli biegać jedynie po poziomych planszach, ale będą mieli do czynienia z całymi światami, złożonymi z wielu poziomów.

Podczas swojej podróży bohaterowie spotykają wiele nowych postaci, m.in. czterech królów, którzy zostali porwani przez wrogów i trzeba ich uwolnić. Nowością jest też zastęp potężnych przeciwników, w tym rycerze i trójgłowe bestie, ale Mario i Luigi nie są sami. Zdobywają również nowe umiejętności, takie jak latanie w przebraniu Tanooki lub użycie młotka jako Super Młotek.

Po pokonaniu przeróżnych przeciwników i zdobyciu wielu skarbów i przedmiotów, Mario i Luigi wkraczają do zamku Bowsera, gdzie muszą zmierzyć się z całym arsenałem czarów i zagrożeń, z którymi król kości stał na ich drodze. W zaciętej walce Mario odnosi jednak zwycięstwo, ratując Królestwo Grzybów i przywołując dawno zapomnianą nadzieję w serca jego mieszkańców.